蛋白质浓度hll

动漫新闻 2020-01-2758未知admin

  蛋白质浓度hll_生物学_自然科学_专业资料。实验六 紫外吸收法和Bradford法 检测蛋白质浓度 一、紫外吸收法 1、原理: 蛋白质中含有共轭双键,在280nm处有 最大吸收值,其吸光度与蛋白浓度成正比。以标 准蛋白作参比即可求得未知

  实验六 紫外吸收法和Bradford法 检测蛋白质浓度 一、紫外吸收法 1、原理: 蛋白质中含有共轭双键,在280nm处有 最大吸收值,其吸光度与蛋白浓度成正比。以标 准蛋白作参比即可求得未知蛋白浓度。 2、器材与试剂 (1)器材 A.紫外分光光度计 B.坐标纸 C.恒温水浴 D.微量加样器 E.移液管 F.试管与试管架 3、试剂 A. 9 g/L NaCl 溶液 B. 标准牛血清白蛋白溶液 牛血清白蛋白0.1克加生理盐水定容 至 100毫升(1mg/ml) C. 待测血清样品 取兔血清0.1毫升,用生理盐水稀释 至 20毫升(已稀释) 4、操作 取3支试管按下表操作: 空白 标准 测定 标准蛋白 (1 mg/ml) 0 4 0 稀释的未知样品(ml) 0 0 4 NaCl 溶液 (ml) 4.0 0 0 轻轻混匀放置3分钟,在280 nm处以空白 调零,测定各管光密度,计算蛋白含量 5、计算公式: 测定O.D/标准O.D X 标准浓度 =待测样品蛋白浓度(mg/mL) 仪器测量误差 由朗伯-比尔定律可知,只有在一定的浓度 范围内,即一定的吸光度范围同内,由分光光度 计测量所引起的测定结果的相对误差才是较小的; 当透光率接近0或1.0时,其相对误差趋于无 限大; 一般在百分透光率在10~80%的范围内(即 吸光度在1~0.1),浓度测量相对误差较小; 对于精密度高的仪器,当吸度A=0.7-0.2时 (百分透光率约为20-60%,测量误差约为1%)。 测量条件选择 (1)选择适宜波长的入射光:由于有色物质对光 有选择性吸收,为了使测定结果有较高的灵敏度,必须 选择溶液最大吸收波长的入射光。 (2)控制吸光度A的准确的读数范围:由朗伯-比 耳定律可知,吸光度只有控制在0.2~0.7读数范围内时, 测量的准确度较高。 (3)选择参比溶液:参比溶液是用来调节仪器工 作零点的。若样品溶液,试剂,显色剂无无色可用蒸馏 水作参比溶液;反之应采用不加显色剂的样品液作参比 溶液。 280nm和260nm的吸收差法 由于核酸在280nm处也有吸收,会干扰蛋白质的测定, 所以同时测定280nm和260nm的光密度值,然后算出 蛋白质的浓度。方法是首先以生理盐水调零点,测定蛋 白质溶液在280nm和260nm吸收值,然后根据经验公 式计算出每毫升溶液中蛋白质的含量。 蛋白质浓度(mg/mL)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm ? 使用紫外分光光度计时,将波长由280nm调 到260nm,需要用对校正“零点”。 因为特定物质溶液的消光系数(k)值取决于物 质性质、入射光波长和温度。同一物质在不 同的波长所测得的K值不同。故对同一溶液而 言,当改变光的波长时,对中参比溶液 的“零点”可能会发生位移,因此需要重新 对“零点”进行校正。 ? ? 优点是无需加入显色剂、操作简便、样品用量极少、低浓 度盐类不干扰测定。因此,在蛋白质和酶的生化制备中被广 泛采用。 缺点是准确度较差,特别是对于测定那些与标准蛋白质的 酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质,有一定的误差。另 外若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外光的物质(如核酸), 则有较强的干扰,须予以校正,且校正后仍存在一定误差。 ? 二、Bradford法测定蛋白质浓度 (一)、原理: 考马斯亮蓝G250与蛋白质结合后形成蓝色的化合物, 在595nm有最大吸收峰,且蓝色的深浅与蛋白浓度成正 比。这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。 该方法快速、准确、干扰因素少。CBB- G-250在2分 钟内即可完全与蛋白结合,并在2小时内保持稳定,该反 应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰,更不受蔗糖等碳水化 合物的干扰。但较高浓度的十二烷基硫酸钠(Soldium dodecyl sulte),Triton X-100等对其有干扰,此影 响可通过选择适当的对照品来消除。 (二)器材及试剂 1、器材 A. 分光光度计 B. 微量加样器 C. 移液管、试管及试管架 D. 坐标纸 2. 试剂 (1)考马斯亮蓝G-250溶液: 称取CBB- G-250 100 mg 溶于 50 ml 950ml/L乙醇 溶液中,然后加入100ml 850 ml/L 磷酸,最后加蒸馏 水定容至1000毫升。 ? (2)0.14mol/L 氯化钠溶液(生理盐水) (3)标准蛋白质溶液(1mg/ml): 精确称取100毫克牛血清白蛋白,用生理 盐水定容至100毫升。 (4) 血清样品(已稀释) ? (三)操作 (标准曲线支试管按下表操作: 空白管 待测1 待测2 标1 标2 标3 标4 标5 待测样品(微升) 标准蛋白(微升) 生理盐水(微升) 100 CBB-G250(ml) 5.0 50 50 5.0 100 0 5.0 20. 40. 60. 80. 100. 80 60 40 20 0.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 混匀,室温放置3分钟,在595nm测定各管O.D值 并以蛋白浓度为横坐标,以O.D值为纵坐标绘制标准曲线。 ? 以Bradford法测定血清的蛋白浓度 取样品,加入考马斯亮蓝G-250溶液 5.0ml,混匀,以595nm 波长测定二者光密 度,在标准曲线上查出其蛋白浓度。

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